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什么是 FLIM 熒光壽命成像?

簡介：

文章要點:

1.熒光壽命成像（FLIM）技術用于測量整個樣品熒光壽命的變化。

2.使用脈沖激光器和時間相關單光子計數（TCSPC）來記錄FLIM圖像。

3.熒光壽命成像（FLIM）提供了傳統熒光強度成像無法獲得的額外信息。

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熒光壽命的概念

熒光壽命是指熒光分子在激發態停留的時間，這個時間可以反映熒光分子的內在屬性和所處的微環境，與局部熒光團濃度和激發強度無關。熒光壽命成像（Fluorescence Lifetime Imaging ，FLIM)）是一種重要的熒光顯微鏡技術，通常用于研究生物分子間相互作用、細胞中的信號事件或區分光譜重疊的熒光團。此外，FLIM 可以提供有關電信號變化、離子和氧含量、溫度、細胞或其環境中的 pH 值的定量信息。FLIM技術因具有非常高的靈敏度和分子特異性而廣泛的應用生物學研究及臨床診斷等領域。

圖 Perrin-Jablonski能級示意圖所示，熒光是分子吸收能量后，基態電子被激發到單線激發態后從第一單線激發態回到基態時所產生的，而熒光壽命是指分子在單線激發態平均停留的時間。分子中處于單線態的基態電子能級S0上的電子，根據Frank-Condon規則吸收某一波長的光子后，被激發到單線態的激發態電子能級S1中的某一個振動能級上，這個過程的時間約為10^-15 s；經過短暫的振動馳豫過程后（時間約10^-12~10^-10 s），S1態的最低振動能級上會積累大量的電子。這一狀態的電子釋放能量回到基態S0能級。

FLIM的黃金標準是時間相關單光子計數（TCSPC）。TCSPC利用快速秒表測量激發脈沖與探測熒光之間的時間差。使用高重復脈沖激發光激發樣品，在每一個脈沖周期內，最多激發熒光分子發出一個光子，然后記錄光子出現的時刻，并在該時刻記錄一個光子，再下一個脈沖周期內也是相同的情況，經過多次計數可以得到熒光光子隨時間的分布曲線。

為什么使用FLIM

熒光壽命成像（FLIM）是一種成像技術，樣品熒光壽命的變化在圖像中產生對比度（圖1）。FLIM廣泛用于生物醫學成像，其中組織和細胞用一種或多種熒光染料染色。染料的熒光壽命取決于局部微環境，FLIM比其他成像技術（如寬場成像）提供了額外的維度，如環境信息。FLIM也越來越多地用于研究光致發光材料，例如對納米材料、太陽能電池和半導體的載流子壽命變化進行成像。

圖1 使用RMS1000共聚焦顯微拉曼光譜儀測量（a）小鼠腸道切片和（b）小鼠腎臟切片的FLIM圖像。

FLIM采集和分析

FLIM采集

熒光衰減是使用時間相關單光子計數（TCSPC）獲得的。在TCSPC中，用脈沖激光激發樣品，并測量激光脈沖和檢測到的熒光光子之間的時間（圖2a）。該過程重復數百萬次，以創建熒光光子計數與到達時間的直方圖（圖2b）。

將樣品上感興趣的區域劃分為像素，并使用TCSPC記錄每個像素的熒光衰減（圖2c）。通過移動樣品臺（樣品臺掃描）或激光點（激光掃描）將激光點引導到每個像素上。這個過程按順序發生，依次記錄每個像素的熒光衰減，以構建直方圖數據合集。

圖2 （a）使用TCSPC記錄單個光子到達時間；（b）單個像素的熒光衰減直方圖；（c）感興趣區域內逐個記錄像素的熒光衰減直方圖。

FLIM分析

計算每個像素熒光衰減直方圖的熒光壽命。通常用最小二乘法將單指數模型擬合到每個衰減來計算，以獲得熒光壽命τ（圖3）。將通過擬合獲得的熒光壽命對應到顏色圖上，構建顏色編碼的熒光壽命圖像。

圖3 計算FLIM數據，每個像素的熒光壽命對應顏色變化，構建顏色編碼的熒光壽命圖像。

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